液相色譜分析法的分離機理是基于混合物中各組分對兩相親和力的差別。根據(jù)固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜。應(yīng)用最廣的是以硅膠為填料的液固色譜和以微硅膠為基質(zhì)的鍵合相色譜。根據(jù)固定相的形式，液相色譜法可以分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。近年來，在液相柱色譜系統(tǒng)中加上高壓液流系統(tǒng)，使流動相在高壓下快速流動，以提高分離效果，因此出現(xiàn)了高效（又稱高壓）液相色譜法。

一、液相色譜分析法分類

高效液相色譜法按組分在固定相和流動相兩者間分離機理不同可分為：液固吸附色譜、化學(xué)鍵合相色譜、液液分配色譜、離子交換色譜法、凝膠色譜法。

1.液固吸附色譜

   液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，如硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，在它們的表面存在吸附中心，各組分在兩相中作相對運動，利用各組分在兩相中吸附作用的不同來進行分離。色譜的分離過程是在吸附劑表面進行的，不進入固定相的內(nèi)部。與氣相色譜不同，流動相(即溶劑)分子也與吸附劑表面發(fā)生吸附作用。在吸附劑表面，樣品分子與流動相分子進行吸附競爭，因此流動相的選擇對分離效果有很大的影響，一般可采用梯度淋洗法來提高色譜分離效率。在聚合物的分析中，吸附色譜一般用來分離添加劑，如偶氮染料、抗氧化劑、表面活性劑等，也可用于石油烴類的組成分析。

2.化學(xué)鍵合相色譜法

化學(xué)鍵合相是利用化學(xué)反應(yīng)通過共價鍵將有機分子鍵合在載體（硅膠）表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成固定相。兼有吸附和分配兩種分離機理，對多數(shù)鍵合相來說，以分配機理為主。通?；瘜W(xué)鍵合相的載體是硅膠，硅膠表面有硅醇基（ ≡Si–OH），它能與合適的有機化合物反應(yīng)，獲得各種不同性能的化學(xué)鍵合相。如：酯化鍵合（≡Si-O-C）、硅氮鍵合（≡ Si-N）和硅烷化鍵合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化鍵合相應(yīng)用最廣泛。十八烷基硅烷鍵合相（Octadecylsilane 簡稱ODS或C18）是最常用的非極性鍵合相。它們用于反相色譜法，可在70℃以下和pH 2～8范圍內(nèi)可正常工作。

化學(xué)鍵合固定相具有如下優(yōu)點：柱效高--傳質(zhì)速度比一般液體固定相快；穩(wěn)定性--耐溶劑沖洗，耐高溫，無固定液流失，從而提高了色譜柱的穩(wěn)定性和使用壽命；應(yīng)用范圍廣--改變鍵合有機分子的結(jié)構(gòu)和基團的類型，能靈活地改變分離的選擇性，適用于分離幾乎所有類型的化合物；且能用各種溶劑作流動相（包括梯度洗脫）。

3.液液分配色譜法

流動相與固定相（在惰性載體表面涂敷或鍵合一層固定液薄膜，涂層固定相或鍵合固定相，鍵合固定相使用更多）為互不相溶的兩種液體，組分既溶解于固定相，也溶解于流動相，被測物質(zhì)在固定相和流動相之間的相對溶解度的差異，通過溶質(zhì)在兩相之間進行分配以實現(xiàn)分離，相當(dāng)于液--液萃取。一般常用的固定液有β,β'-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEG400～4000)、三甲撐乙二醇(TMG)和角鯊?fù)?SQ)等。采用與氣相色譜(GC)同樣的方法，將固定液涂漬在多孔的載體表面，但在使用中固定液易流失。目前，應(yīng)用較多的是鍵合固定相。在這種固體相中，固定液不是涂在載體表面，而是通過化學(xué)反應(yīng)在純硅膠顆粒表面鍵合上某種有機基團。例如，利用氯代十八烷基硅烷與硅膠表面的羥基(-OH)之間的反應(yīng)就可以形成一烷基化表面。這種固定液的優(yōu)點是不易被流動相剝蝕。在分配色譜法中，流動相可為純?nèi)軇?，也可以采用混合溶劑進行梯度淋洗，其極性應(yīng)與固定液差別大一些，以避免兩者之間相溶。

根據(jù)固定相與流動相的極性不同，分為正相色譜和反相色譜。正相色譜是用硅膠或極性鍵合相為固定相，非極性溶劑為流動相；反相色譜是硅膠為基質(zhì)的烷基鍵合相為固定相，極性溶劑為流動相，適用于非極性化合物的分離。

4.離子交換色譜法

離子交換色譜通常以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子（樣品離子）與固定相離子進行可逆交換，其交換能力的差別或選擇性系數(shù)的差別而實現(xiàn)分離的色譜方法稱為離子交換色譜法。按照可交換離子所帶電荷符號的不同又可分為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。薄殼型離子交換樹脂柱效高，主要用來分離簡單的混合物；多孔性樹脂進樣容量大，主要用來分離復(fù)雜混合物。

離子交換樹脂缺點是易于膨脹，傳質(zhì)較慢，柱效低，不耐高壓。HPLC中的固定相是鍵合在薄殼型和多孔微粒硅膠上的離子交換劑，其機械強度高，不溶脹，耐高壓，傳質(zhì)快，柱效高。

離子交換色譜法的流動相是具有一定pH值和離子強度的緩沖溶劑，或含有少量有機溶劑，如甲醇、乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以提高色譜選擇性。

離子交換色譜法的保留行為和選擇性（吸附性）與被分離的離子、離子交換劑以及流動相的性質(zhì)等有關(guān)。離子交換劑對不同離子的交換選擇性不同，一般來說，離子的價數(shù)越高，原子序數(shù)越大，水和離子半徑越小，則該離子在離子交換劑上的選擇性系數(shù)就越大。

強酸型陽離子交換樹脂對陽離子的選擇性系數(shù)順序為：Fe³⁺〉A(chǔ)l²⁺〉Ba²⁺〉Pb²⁺〉Sr²⁺〉Ca²⁺〉Ni²⁺〉Cd²⁺〉Cu²⁺〉Co²⁺〉Mg²⁺〉Zn²⁺〉Mn²⁺〉A(chǔ)g⁺〉Cs〉Rb⁺〉K⁺〉NH⁴⁺〉Na⁺〉H⁺〉Li⁺。

弱酸型陽離子交換樹脂的基團（如一COOH）的離解受溶液中H⁺抑制，所以H⁺在該類樹脂上的保留能力很強，甚至大于二價、三價陽離子。

強堿型陰離子交換樹脂對陰離子的選擇性系數(shù)順序為：檸檬酸根〉PO₄^3-〉SO₄^2-〉I^-〉NO^3-〉SCN^-〉NO^2-〉Cl^-〉HCO^3-〉CH₃COO^-〉OH^-〉F^-。

離子的保留還受流動相的組成和pH值的影響：交換能力強、選擇性系數(shù)大的離子組成的流動相具有強的洗脫能力。流動相的離子強度增大，其洗脫能力增強，使組分的保留值降低。強離子交換樹脂的交換容量在很寬的范同內(nèi)不隨流動相的pH值變化。pH值的調(diào)節(jié)主要體現(xiàn)其對弱電解質(zhì)離解的控制，溶質(zhì)的離解受到抑制，其保留時間變短。因此，pH值的變化，對弱離子交換樹脂的交換能力影響較大。

離子交換色譜法是新發(fā)展起來的一項現(xiàn)代分析技術(shù)，已廣泛用于氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)的分析，也適合于某些無機離子(NO^3-、SO₄^2-、Cl^-等無機陰離子和Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺等無機陽離子)的分離和分析，具有十分重要的作用。

4.凝膠滲透色譜法

凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進行分離的一種色譜分析方法。又稱為尺寸排阻色譜法。1959年首先用于生物化學(xué)領(lǐng)域。以溶劑為流動相，多孔填料（如多孔硅膠、多孔玻璃）或多孔交聯(lián)高分子凝膠為固定相（軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠和硬質(zhì)凝膠）的液相色譜法?；旌衔锶芤哼M入凝膠色譜柱，流經(jīng)多孔凝膠時，體積比多孔凝膠孔隙大的分子不能滲透到凝膠孔隙里去而從凝膠顆粒間隙中流過，較早地被沖洗出柱外，而小分子可滲透到凝膠孔隙里面去，較晚地被沖洗出來，混合物經(jīng)過凝膠色譜柱后就按其分子大小順序先后由柱中流出達到分離的目的。

凝膠滲透色譜的優(yōu)點：分離不需要梯度沖洗裝置；同樣大小的柱能接受比通常液相色譜大得多的試樣量；試樣在柱中稀釋少，因而容易檢測；組分的保留時間可提供分子尺寸信息；色譜柱壽命長。它的缺點是：不能分離、分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上時才能得到分離。分子尺寸相同的混合物，色譜柱的分離度低；峰容量小；凝膠滲透色譜法適宜于分離相對分子質(zhì)量大的化合物，相對分子質(zhì)量在400～8×10⁵的任何類型的化合物，此外還可用來分離低聚物、單體和聚合物添加劑等。

目前，凝膠色譜法既適用于水溶液的體系，又適用于有機溶劑的體系。當(dāng)所用的洗脫劑為水溶液時，稱為凝膠過濾色譜，其在生物界的應(yīng)用比較多；采用有機溶劑為洗脫劑時，稱為凝膠滲透色譜，在高分子領(lǐng)域應(yīng)用較多。

5.離子色譜法

根據(jù)不同的分離方式，離子色譜可以分為高效離子色譜 、離子排斥色譜和流動相離子色譜3類。高效離子色譜法使用低容量的離子交換樹脂，分離機理主要是離子交換。離子排斥色譜法用高容量的樹脂，分離機理主要是利用離子排斥原理。流動相離子色譜用不含離子交換基團的多孔樹脂，分離機理主要是基于吸附和離子對的形成。

離子色譜儀由淋洗液貯存器 、泵 、進樣閥 、分離柱 、抑制柱、電導(dǎo)檢測器和數(shù)據(jù)處理單元等組成。離子色譜儀最重要的部件是分離柱，裝有離子交換樹脂。抑制柱是抑制型離子色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將淋洗液轉(zhuǎn)變成低電導(dǎo)部分，以降低來自淋洗液的背景電導(dǎo)，同時將樣品離子轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的酸或堿，以增加其電導(dǎo)。

分離陰離子，抑制柱填充強酸性陽離子交換樹脂；分離陽離子，抑制柱填充強堿性陰離子交換樹脂。檢測器分通用型檢測器與專用型檢測器。前者如電導(dǎo)檢測器，對檢測池中所有離子都有響應(yīng)；后者如紫外-可見分光光度計，對離子具有選擇性響應(yīng)。

6.離子對色譜法

離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與樣品離子電荷（A⁺）相反的離子（B^-，稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)的流動相（或固定相）中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對（呈中性締合物）。該離子對不易在水中離解而迅速進入有機相中，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。

離子對色譜法(特別是反相)解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如有機酸、堿及離子、非離子混合物，如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。

二、液相色譜的固定相和流動相的選擇

液相色譜固定相主要有液固吸附色譜固定相、液液分配色譜固定相、離子交換色譜鍵合固定相和凝膠色譜固定相等類型。
1.液相色譜固定相的分類及組成

1.1液固吸附色譜 

1.1.1硅膠：為剛性固體。表面多孔硅膠：在30～40μm的玻璃微球表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠而成。易裝柱，柱效不高，柱容量小。全多孔硅膠。無定形全多孔硅膠：柱效高，柱容量大，價廉。但要勻漿裝柱。球形全多孔硅膠：柱效高，柱容量大，渦流擴散小，滲透性好，價廉。全多孔微粒硅膠：傳質(zhì)阻抗小，柱容量大。
1.1.2分子篩：為強極性。
1.1.3高分子多孔微球：非極性高分子多孔微球：由苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)而成。柱選擇性好，峰形好，柱效低。適合分離弱極性化合物。極性高分子多孔微球：在苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)而成的聚合物中引入極性官能團而成。
1.1.4氧化鋁：為弱極性。

1.1.5活性炭：為非極性。

1.2液液分配色譜：固定相由載體和固定液組成。

1.2.1涂漬固定液：載體有硅膠、氧化鋁和硅藻土等。硅膠有表面多孔硅膠、無定形全多孔硅膠、球形全多孔硅膠和全多孔微粒硅膠。目前械涂漬固定液已逐漸被鍵合固定相取代。
1.2.2鍵合固定相：載體有200～300m²/g的硅膠和聚合物（如聚苯乙烯和聚乙烯醇膠等）。目前載體幾乎都是硅膠，有表面多孔硅膠、無定形全多孔硅膠、球形全多孔硅膠和全多孔微粒硅膠。
1.2.2.1非極性鍵合固定相：鍵合非極性基團，常用十八烷基硅烷鍵合固定相（ODS）。用于反相色譜。
1.2.2.2弱極性鍵合固定相：常用醚基和二羥基等鍵合固定相。用于反相或正相色譜。
1.2.2.3極性鍵合固定相：鍵合極性基團，常用氨基和氰基等鍵合固定相。用于正相色譜。

1.3離子交換色譜：將離子交換基團鍵合到硅膠基質(zhì)表面上形成的鍵合固定相。載體有硅膠、合成樹脂和纖維素等，多為全多孔微粒硅膠。離子交換基團有－SO₃H（強酸型）和－NR₃Cl（強堿型）等。

1.4凝膠色譜：凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，含有大量液體（一般為水），柔軟而富于彈性。有軟性凝膠、半剛性凝膠和剛性凝膠。

2. 流動相分類

按組成：單組分、多組分；按極性：極性、弱極性、非極性；按使用方式：固定組成洗脫、梯度洗脫。常用溶劑：甲醇、乙醇、乙腈、水、己烷、四氯化碳、乙酸乙酯等。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，可以改進分離或調(diào)整出峰時間。常見溶劑的極性順序：水>乙腈>甲醇>乙醇>四氫呋喃>乙酸乙酯>四氯化碳>環(huán)己烷。常用流動相：甲醇+水，乙腈+水，乙酸銨溶液，磷酸及磷酸鹽溶液等。

3.流動相的選擇

選擇高純度試劑，如色譜純試劑，使用前經(jīng)濾膜過濾。防止微量雜質(zhì)進入色譜柱和儀器系統(tǒng)；配制的流動相溶液要進行過濾。儲存流動相的容器有透明玻璃瓶和棕色瓶，需要避光的流動相首選棕色瓶盛裝。

(1) 流動相能溶解試樣，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)；

(2)與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)，不能發(fā)生作用使柱效下降或損壞色譜柱；

(3)粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效；

(4)應(yīng)與所用檢測器相匹配。例如利用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收；

(5)容易精制、純化、毒性小，不易著火、價格盡量便宜等；

(6)要求流動相對固定相的溶解度盡可能??；

(7)固定液是極性物質(zhì)時，選用的流動相通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑，稱為正相分配色譜，適合于分離極性化合物；

(8)選用非極性物質(zhì)為固定相，而極性溶劑為流動相的液液色譜稱為反相分配色譜，這種色譜適合分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。

三、液相色譜和氣相色譜方法比較

紫外吸收檢測器（UVD）、二極管陣列檢測器（PDAD）、熒光檢測器（FLD）、電化學(xué)檢測器(ED或ECD)、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、示差折光檢測器（RID）、質(zhì)譜檢測（MSD）                                                                                                                                               四、液相色譜分析法的應(yīng)用

可以分離分析分子量大的、熱不穩(wěn)定的、不具揮發(fā)性的、可以離解或不離解的各種分子量的物質(zhì)。如NO₃^-、SO₄^2-、Cl^-等無機陰離子和Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺等無機陽離子，染料、抗氧化劑、防腐劑、苯酚等。這些物質(zhì)可以是離子態(tài)的、分子態(tài)的、同分異構(gòu)體（如2,4-二氨基甲苯和2,6-二氨基甲苯）或具有生化活性的物質(zhì)，如DNA（由脫氧核苷酸組成的大分子聚合物,由堿基、脫氧核糖和磷酸構(gòu)成。堿基4種:腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)）。

液相色譜儀廣泛應(yīng)用于藥物研制和生產(chǎn)、環(huán)境檢測、生物化學(xué)、衛(wèi)生檢驗、食品安全、國土安全、石油化工、科學(xué)研究等領(lǐng)域。能對有機化合物中百分之七十到百分之八十的化合物進行分離與分析。

生活飲用水標準檢驗方法(有機物指標GB/T 5750.8-2006、農(nóng)藥指標GB/T 5750.9-2006）共有7個指標可用液相色譜法進行測定，采用紫外檢測器可以分析微囊藻毒素、甲萘威、溴氰菊酯、莠去津，采用熒光檢測器可以分析苯并（a）芘、呋喃丹和甲萘威、草甘磷。其中熒光檢測器和紫外檢測器均可測定甲萘威。

工作場所空氣有毒物質(zhì)測定（ GBZ/T160、GBZ/T300指標對應(yīng)方法），采用紫外檢測器可以分析苦味酸（三硝基苯酚）、β-萘酚、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯、考的松、18-甲基炔諾酮（炔諾孕酮）、五氯酚及其鈉鹽、三氯乙醛、氫醌、對甲苯磺酸、馬來酸酐、硫酸二甲酯、鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、異佛爾酮二異氰酸酯、硝基胍、黑索金（環(huán)三次甲基三硝胺）、苯醌、甲苯二異氰酸酯、二苯基甲烷二異氰酸酯，采用熒光檢測器可以分析蒽、菲、3,4苯并芘。使用十八烷基硅烷鍵合相色譜柱（Octadecylsilane 簡稱ODS或C18），250mm×4.6mm×5μm，可以完成工作場所空氣中上述有毒物質(zhì)的分離分析。