一.目的

對(duì)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行合理的操作，確保菌株的長(zhǎng)久使用和性能的穩(wěn)定。

二.傳代實(shí)驗(yàn)

1.將在室溫放置30分鐘的菌種斜面管移入超凈工作臺(tái)中。

2.點(diǎn)燃酒精燈，先用左手將菌種管的試管口斜向上靠近火焰，緩慢旋轉(zhuǎn)加熱滅菌。用右手在火焰旁輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)橡膠塞，以便易拔取，再用右手持接種環(huán)在火焰上燒紅30秒，隨后將全部鉑金絲及金屬棒部分在火焰上灼燒，往返通過(guò)3次。

3.在火焰旁，用右手的無(wú)名指、小指及手掌部夾住橡膠塞，輕輕拔出橡膠塞，并勿使其與任何物品接觸。將灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，待冷后，從斜面上挑取少量菌苔，取出時(shí)，接種環(huán)放置在火焰旁。左手的菌種管口旋轉(zhuǎn)地在火焰上受熱滅菌，右手無(wú)名指、小指及手掌部夾住的橡膠塞快速地來(lái)回通過(guò)火焰，并迅速塞回菌種管上。再將菌種管的管口處在火焰上滅菌。

4.同樣的操作，將接種管的橡膠塞拔出，把粘有菌種的接種環(huán)輕貼斜面的表面，由下到上曲折移動(dòng)，使菌種劃在斜面的表面上，注意只劃動(dòng)一次，勿重復(fù)移動(dòng)，且勿使菌苔沾在管壁口。再用同樣的操作將橡膠塞塞回接種管，然后將接種管的管口處在火焰上滅菌。接種過(guò)的接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌。

已接種完畢的各管貼好標(biāo)簽，注明菌名、編號(hào)、代次（n+1）和傳代日期、操作人、有效期，同時(shí)填好《菌種使用記錄表》。

5.按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)。

6.培養(yǎng)到期后取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形狀，是否正常，并與上代菌種比較，有無(wú)雜菌。必要時(shí)涂片，革蘭氏染色鏡檢。

檢查合格的菌種，放入冰箱內(nèi)2-8℃保存，一般一個(gè)月轉(zhuǎn)鐘一次。一般情況：當(dāng)工作菌株小于5代時(shí)可直接用上一代工作用菌種接種下一代工作用菌種，作為工作用菌種。也可選用保存的菌種進(jìn)行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。細(xì)菌每1個(gè)月傳代一次，酵母菌每2個(gè)月傳代一次，霉菌及芽孢每3個(gè)月傳代一次。當(dāng)超過(guò)5代，需用傳代用菌種傳代。傳代時(shí)應(yīng)無(wú)菌操作，使菌株不死亡、不污染、不丟失。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)采取有效的預(yù)防措施進(jìn)行自我保護(hù)，穿好工作服，佩戴無(wú)菌手套，實(shí)驗(yàn)完成后對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域、實(shí)驗(yàn)儀器和器具進(jìn)行消毒。

菌株編號(hào)：傳代用菌種可用字母“G”表示，工作用菌種可用字母“W”表示。菌種的英文縮寫：大腸埃希氏菌（E.c），金黃色葡萄球菌（S.a），白色念珠菌（C.a）等等。傳代日期用6位數(shù)字表示，年份取最后兩位數(shù)，如2021年06月21日傳代的第一支大腸埃希氏菌作為傳代用菌種的編號(hào)為:E.c-G3-210624-01。

三.保存方法

1.斜面低溫保藏法

1.1操作方法

無(wú)菌條件下，將待保存的菌株菌落或懸濁液，以無(wú)菌操作接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮的菌種的橡膠塞部分用牛皮紙包扎好，移至2-8℃的冰箱中低溫保藏，保藏時(shí)間依微生物的種類不同而確定。定期對(duì)保存的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)種，轉(zhuǎn)種頻率為一月一次。

1.2 注意事項(xiàng)

①必須定期檢查保藏菌種冰箱溫度和菌種管的橡膠塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。

②每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確保培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后在繼續(xù)保藏。

2.瓷珠菌種保管法

2.1 操作方法

在無(wú)菌條件下，用浸過(guò)75%酒精的脫脂棉擦凈凍存管表面并讓其自然風(fēng)干，打開凍存管的螺旋瓶蓋，用滅菌的接種環(huán)挑取待保存的菌株菌落或懸濁液，放入凍存液中；擰緊瓶蓋，來(lái)回顛倒使菌體乳化為混濁的菌懸濁液，此時(shí)菌懸濁液會(huì)吸附在小瓷珠內(nèi)外表面；用無(wú)菌移液器將凍存管中的菌懸濁液盡量吸出（吸出的菌懸濁液應(yīng)放入消毒液中并隨后進(jìn)行高壓滅菌處理）；擰緊瓶蓋貼上相應(yīng)的詳細(xì)標(biāo)簽，并做好相關(guān)菌種記錄，將凍存管置于-20℃冰箱中密封上鎖保存。

3.液體石蠟保藏法

3.1 操作方法

將液體石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，塞上具砂芯的硅膠塞，并用牛皮紙包扎，121℃滅菌30min，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，用無(wú)菌吸管吸取無(wú)菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm，使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20℃冷凍或冷藏保存。

4.甘油冷凍保藏法

4.1 操作方法

刮取平板或瓊脂斜面的培養(yǎng)物，放入裝有無(wú)菌純化水的試管中，通過(guò)接種環(huán)與試管壁間的摩擦，使細(xì)菌充分?jǐn)U散到純化水中，制備成菌懸液。向已制備好的菌懸液中加入等體積的無(wú)菌甘油（濃度20%（V/V）），即為10%（V/V）甘油菌懸液，輕輕振搖，充分混合后，分裝于無(wú)菌小試管或凍存管，冷凍保存。-20℃保存，一般菌株可保存3年以上，鏈球菌、奈瑟菌可保存12-15個(gè)月。

（檢驗(yàn)分析中心）